Lo que las imágenes Raman pueden revelar

Las imágenes Raman pueden mostrar la distribución de especies químicas y estructurales de una muestra. Vea cómo obtener y analizar imágenes Raman.

Imágenes cualitativas y cuantitativas Raman

Las imágenes Raman de color falso son la forma más adecuada de enfatizar la distribución de propiedades químicas y estructurales de una muestra. El brillo, el contraste y el color de la imagen se pueden usar para destacar la composición del material. Al superponer imágenes individuales Raman, puede mostrar la distribución de varias especies o propiedades al mismo tiempo.

¿Cómo se obtienen las imágenes Raman?

Un microscopio Raman obtiene los espectros Raman en cada posición de la muestra. A continuación, se guardan los espectros Raman en un único archivo de datos, denominado hipercubo espectral. Para finalizar, se analiza el hipercubo espectral para generar las imágenes Raman.

Hay varios métodos de generar imágenes Raman, como:

Enfocar el punto
El microscopio Raman enfoca el láser en un punto de la muestra. La muestra se coloca en una plataforma motorizada y la coloca debajo del láser. El espectrómetro obtiene los espectros de una serie de puntos de la muestra.

Las versiones rápidas de imagen de enfoque de puntos son las tecnologías StreamHR™ y StreamHR™ Rapide. Las imágenes Raman con tecnología StreamHR Rapide adquieren más de 1000 puntos espectrales por segundo.

El diagrama muestra la generación de imágenes punto por punto, que representan el muestreo óptimo y el submuestreo.

Enfoque de línea
El láser ilumina una línea de la muestra en vez de un punto. Esto le permite recoger simultáneamente espectros en varias posiciones de la muestra, ahorrando tiempo con ello. Con este método se pueden utilizar potencias láser totales más altas sin dañar la muestra. La tecnología de imágenes StreamLine™ de Renishaw es una moderna y sofisticada implementación de este concepto. El láser ilumina una línea vertical de la muestra en vez de un punto.

Para generar imágenes, es importante considerar los posibles efectos no deseados del submuestreo cuando. El submuestreo se realiza si el punto láser es más pequeño que la distancia entre los puntos de adquisición. Renishaw ha solucionado este problema mediante la tecnología StreamLine con modo Slalom.

La tecnología de imágenes Streamline™ con modo Slalom asegura una cobertura completa de la muestra, incluso en tamaños de mayor paso (píxel). Puede obtener imágenes rápidas Raman de muestras mayores sin perder datos.

Una imagen Raman muestra la organización del tejido en un colon sano de rata. Para crear esta imagen se ha utilizado PCA.

¿Cómo se analizan las imágenes Raman?

Es posible analizar espectros Raman de un experimento de imágenes para obtener perfiles 1D, imágenes 2D o volúmenes 3D. La imagen Raman puede mostrar parámetros de banda univariable individuales, como la intensidad de una banda Raman. También puede realizar un análisis multivariable completo del espectro Raman del hipercubo espectral.

El software WiRE™ de Renishaw incluye varias opciones de análisis de datos para la generación de imágenes Raman:

Intensidad en una frecuencia del espectro
Estas imágenes se generan rápidamente, pero pueden ser engañosas porque no es posible diferenciar entre las intensidades resultantes de la banda Raman que nos interese y las asociadas con una posible fluorescencia de fondo.

Parámetros de ajuste de la curva
Por cada espectro de una imagen Raman, puede ajustar una curva teórica para cada banda Raman. Puede calcular parámetros de banda Raman, como desplazamiento Raman, anchura de banda o intensidad relativa. A menudo, las imágenes Raman muestran variaciones en el desplazamiento Raman de una banda, lo que puede indicar tensión localizada. También muestran variaciones en la anchura de banda Raman, lo que puede indicar distintos niveles de cristalinidad.

Parámetros multivariables
El análisis multivariable es muy completo, ya que utiliza la información de todo el espectro, no sólo de una parte de este (p.ej., intensidad a una frecuencia o de una banda de curva ajustada). Normalmente, esto produce imágenes Raman de mejor especificidad química.

Si dispone de espectros de referencia de los componentes químicos de la muestra, puede crear fácilmente imágenes Raman que muestren su distribución. En estos casos, utilizaría métodos de análisis de componentes por mínimos cuadrados clásicos directos (DCLS) o cuadrados mínimos no negativos (NNLS). Puede usar estos métodos de análisis de componentes para obtener una estimación de concentración cuantitativa.

Si no dispone de espectros de referencia, puede crear imágenes Raman mediante métodos quimiométricos sin supervisión, como el análisis de componentes principales (ACP) de la función del software EmptyModelling™ de Renishaw. Puede usar los modos quimiométricos sin conocer el contenido de la muestra. Estos métodos analizan la variación sistemática entre los espectros Raman para predecir componentes espectrales. A continuación, una imagen Raman muestra la distribución de los componentes espectrales de la muestra.

A menudo se utiliza un análisis de grupo y PCA para analizar las imágenes Raman de tejidos biológicos y células. Estos completos métodos quimiométricos pueden detectar estructuras de muestras biológicas que a menudo contienen composiciones bioquímicas impuras.

La función EmptyModelling es una versión fácil de usar del análisis de resolución de curvas multivariable alternando métodos de mínimos cuadrados (MCR-ALS). Este método puede crear imágenes Raman de muestras que identifican áreas desconocidas de componentes. Esto es importante para muestras como obleas de semiconductores o fórmulas farmacéuticas.